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彼得 帕克（托比?马奎尔 Tobey Maguire 饰）只是美国一个平凡的高中生，当一次他被蜘蛛博物馆偷跑出来的变种蜘蛛咬了一口之后，彼得的生活彻底改变了。他变得和蜘蛛一样，拥有各种蜘蛛特有的超能力：从手指喷出粘力极强的蜘蛛丝、飞檐走壁等等。彼得兴奋异常，开始利用自己的超能力去赚钱。但当他最爱的叔叔被自己放走的罪犯杀死后，彼得发誓要用自己的超能力去打击犯罪。
彼得好友哈利的父亲诺曼（威廉?达福 Willem Dafoe 饰）是一家生物科技公司的老板，因自己公司生产的飞行器没得到军方首脑赏识而苦恼不堪
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正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化。偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的